HPLC Doppelpeaks und unruhige Basislinie: Die Ursache können Algen, Bakterien oder Biofilm in der HPLC sein

Bei HPLC Doppelpeaks, unruhige Basislinie und steigender Druck ist meist nicht die Säule die Ursache, es kann auch eine mikrobiologische Belastung (HPLC Algen) sein. Ein Praxisfall aus dem HPLC-Troubleshooting.

Ein Kunde hatte ein scheinbar unlösbares Problem: HPLC Doppelpeaks, unruhige Basislinie, ein Druckanstieg von 50 bar und der SST schlug mehrmals aufgrund eines schlechten Signal-Rausch-Verhältnisses fehl. 5 neue Säulen und andere HPLC-Anlagen brachten keinen Erfolg. Auch sämtliche Reagenzien-Chargen gewechselt: Keine Verbesserung!

Die Ursache: Algen, Bakterien oder Biofilm in der Fritte des Eluenten-Filters

Die Fehlersuche war sehr ausführlich. Der Kunde ging die Punkte systematisch durch. 👉 [Hier zum ultimativen HPLC Troubleshooting-Guide →] Es stellte sich heraus, dass die Ursache der HPLC Doppelpeaks nicht an der Säule oder am Gerät lag, sondern VOR der Säule. Das Problem steckte in der Fritte des Eluenten und/oder im System. Dort hatte sich ein Algen- bzw. Biofilm-Bewuchs gebildet, der das System beeinflusste, zunehmend verstopfte und die Basislinie destabilisierte.

Der eine Eluent bestand aus einem 100 % wässrigen Puffer. Ein rein wässriger Eluent ohne organischen Anteil ist ein idealer Nährboden für mikrobielles Wachstum, vor allem, wenn Ansatzgefäße, Schläuche oder Fritten nicht regelmäßig desinfiziert werden. Besonders anfällig sind hier pH-neutrale wässrige Puffer wie Phosphat-, Acetat-, Formiat-, Citrat- oder TBAHS-Puffer. Sie besitzen selbst keinerlei antimikrobielle Wirkung und bieten in Kombination mit einem hohen Wasseranteil ideale Wachstumsbedingungen für Bakterien und Algen.

Begünstigt wird dieses Wachstum zusätzlich durch zwei klassische, oft unterschätzte Faktoren:

• Stehender Eluent – etwa über Nacht oder am Wochenende ohne Fluss
• Tageslichteinfall auf Vorratsflaschen und Schläuche

Beide Faktoren beschleunigen das Algenwachstum in der HPLC erheblich. Oft genügen bereits wenige Stunden bis einen Tag, bis sich der Biofilm bildet.

Die Symptome im Überblick: HPLC Doppelpeaks und unruhige Basislinie

Ein Algenbefall in HPLC führte zu einem charakteristischen Fehlerbild:

• Die Fritte „verstopft“ zunehmend mikrobiell: Eluentwechsel hilft nur kurzfristig
• Die Basislinie wird unruhig, das Signal-Rausch-Verhältnis verschlechtert sich
• Peaks spalten sich auf (Doppelpeaks)
• Der Systemdruck steigt kontinuierlich an

Neu angesetzte Eluenten hielten mitunter nur wenige Injektionen, bevor das Problem erneut auftrat. Besonders tückisch: Selbst brandneue Säulen zeigten die Symptome sofort wieder, weil das eigentliche Problem gar nicht auf der Säule lag, sondern vorgelagert in der Fritte. Die Verschmutzung durch Algen in der HPLC kann sich auf weitere Komponenten wie Mischkammer, Pumpe, Filter und Detektor ausweiten.

So verhinderst du HPLC Doppelpeaks durch Algen

Die Lösung erwies sich als überraschend einfach:

1. Bei Befall das komplette HPLC-System desinfizieren, inklusive Schläuche, Fritten und Vorratsbehälter
2. 10 % Acetonitril in den wässrigen Eluenten geben, um zukünftiges mikrobielles Wachstum wirksam zu verlangsamen
3. Falls du dennoch 100 % wässrigen Puffer verwenden musst, stelle den Eluenten immer frisch her und lass ihn nicht über Nacht stehen. Spüle vor dem Feierabend dein HPLC-System ausgiebig.

Achtung: Die Zugabe von Acetonitril kann die chromatographische Methode grundlegend beeinflussen (Selektivität, Retentionszeiten, Trennleistung). Dies macht womöglich eine Revalidierung der Methode notwendig.

HPLC-Desinfektion: So gehst du vor

Um einen Befall der HPLC mit Algen, Bakterien oder Biofilm zu entfernen, muss die HPLC desinfiziert und gereinigt werden.

Warnung: Verwende nur Reinigungs- resp. Desinfektionslösungen, die der Hersteller empfiehlt. Harsche Chemikalien können dein System beschädigen, vor allem bioinerte Systeme. Überprüfe vor der Desinfektion die Empfehlungen deines Herstellers!

Schonende HPLC-Desinfektion (bei geringer Kontamination)

Bei geringem Algenbefall würde ich die schonende Desinfektion der HPLC mit Isopropanol versuchen. Das Vorgehen ist genau so, wie wenn du die HPLC für eine längere Zeit abschaltest. Du findest die genaue Anleitung hier 👉 Anleitung HPLC für längere Zeit abschalten →:

1. Säule und System pufferfrei spülen, falls du Puffer verwendet hast (siehe genaue Anleitung oben im Link)
2. Säule auf Lagerbedingung spülen (z.B. 100 % Acetonitril für RP-C18-HPLC-Säulen)
3. Bridge einbauen (anstatt HPLC-Säule, ein Verbindungsstück einbauen)
4. Komplettes System inkl. ALLER Eluentenkanäle, Fritten, Bypass, etc ausreichend mit HPLC-Wasser spülen.
5. Entferne die Fritten der Eluenten, desinfiziere sie separat (oder nimm später Neue) und füge alle in eine frisch hergestellte Flasche mit Desinfektionslösungsmittel aus Punkt 6.
6. Fülle das Desinfektionslösungsmittel 70 % Isopropanol in HPLC-Wasser in eine neue Eluentenflasche und stecke alle Schläuche rein
7. Purge alle Kanäle ausreichend, sodass der alte Eluent mit Isopropanol ersetzt wurde (ca. 5 Minuten)
8. Spüle alle Komponenten wie Bypass, Injektor, Säulenschaltventil und ggf. anderer Säulenwege
9. Lass die HPLC mit kleinem Fluss (z.B. 0,1 mL/min) für eine halbe Stunde laufen. Vergiss nicht die anderen Kanäle der Eluenten zu spülen. Wichtig: Achte auf den Druck, da Isopropanol eine höhere Viskosität hat
10. Berücksichtige ALLE Komponenten und Wege wie Bypass, Säulenschaltventil und Wege, Injektor, etc.
11. Installiere die desinfizierten Fritten wieder oder nimm Neue
12. Spüle die HPLC wieder um

Empfohlene Reinigung der Hersteller (Waters, Agilent, ThermoFisher)

Je nach Hersteller werden unterschiedliche Vorgehensweiten und Reinigungsmittel empfohlen. Prüfe vor der Desinfektion die Anleitung deines Systems. Das generelle Vorgehen:

1. Entferne die HPLC-Säule und installiere die Bridge (Verbindungsstück anstatt Säule)
   Achtung: Stelle sicher, dass die HPLC-Säule vor der Lagerung frei von Puffer oder Modifier ist und sie in Lagerlösungsmittel gelagert wird.
2. Falls du das System vorher mit Puffer oder Modifier betrieben hast, spüle alles mit 100 % HPLC-Wasser, prime alle Verbindungen
3. Entferne die Fritten (ggf. solvent sinker) der Eluenten und desinfiziere sie separat (siehe Anleitung unten)
4. Füge alle Eluentenschläuche in die Flasche mit der Reinigungslösung (siehe empfohlene Reinigungslösung)
5. Entferne den Detektor aus dem Spülweg durch das Lösen der Kapillare VOR dem Detektor.
6. Spüle das komplette System mit der Reinigungslösung
   Purge alle Kanäle ca. 5 Minuten und spüle dein System für mindestens 2 Stunden mit kleinem Fluss. Bei einer großen Kontamination des HPLC-Systems, kannst du auch über Nacht spülen. Hier empfiehlt es sich, den Druck in der Software zu begrenzen, um das System bei einem Druckproblem zu schützen.
7. Spüle mit Wasser
8. Installiere wieder die desinfizierten Fritten (oder nimm neue) und fülle die Eluenten (frisch angesetzt)
9. Installiere die Säule

Empfehlung vom Agilent-Techniker: Desinfektion mit Agilent Reinigungslösung (siehe unten), danach gründlich mit HPLC-Wasser spülen, gefolgt von 70 % Isopropanol. (Durch die höhere Viskosität von Isopropanol/Wasser werden Partikel besser herausgespült)

Vom Hersteller empfohlene Reinigungslösungen

Agilent: Verwenden Sie die folgenden Lösungen nacheinander jeweils für mindestens 30 min bei einer moderaten Flussrate (0,5 – 1 mL/min) [Quelle Agilent]:

1. Wasser
2. 0,1 M NaOH
3. Wasser
4. 0,13 M HCl
5. Wasser

Waters: Zu gleichen Teilen 25:25:25:25 (Magic-Water-Mix) [Quelle Waters]:

• HPLC-Wasser
• Acetonitril
• Methanol
• Isopropanol mit 0.1–2 % Ameisensäure

ThermoFisher: Der Hersteller geht in seiner Betriebsanleitung nur auf die äußere Reinigung und Dekontamination ein. [Quelle ThermoFisher] Anfrage bei ThermoFisher habe ich gestellt.

Desinfektion der Fritten

Falls du deine Fritten selbst desinfizieren möchtest, hier ein bewährtes Vorgehen aus der Praxis:

1. Entferne die Fritten vom Eluentenschlauch
2. Lege sie in ein Becherglas mit deionisiertem Wasser und ultraschallbadiere die Fritten für mindestens 15 Minuten
3. Spüle die Fritten mit deionisiertem Wasser ab
4. Lagere sie über Nacht in 30 % Ethanol p.a.
5. Trockne die Fritten im Trockenschrank bei 60 °C

Empfehlung: Ich empfehle dir, diese Schritte regelmäßig durchzuführen, auch wenn du keinen Algenbefall hast. Vor allem die Fritte im wässrigen Eluenten bedarf regelmäßiger Reinigung, vor allem wenn du mit Puffer arbeitest.

Die Lehre daraus: HPLC Doppelpeaks von Algen

Nicht jedes Peakform-Problem ist ein Methoden-, Säulen- oder Geräteproblem. Manchmal sitzt der Übeltäter mikroskopisch klein in der Fritte und/oder System.

Meine Empfehlung für deine Praxis:

• Rein wässrige, pH-neutrale mobile Phasen nicht über längere Zeiträume stehen lassen
• Vorratsflaschen und Schläuche vor Tageslicht schützen
• Generell geringer organischer Lösungsmittelanteil hinzugeben (z.B. Acetonitril), um das Algenwachstum zu reduzieren (wenn methodisch vertretbar).
• Bei wiederkehrenden, scheinbar unerklärlichen Basislinien- oder Peakform-Problemen auch die Fritten und Filter auf mikrobiellen Bewuchs prüfen und System ggf. desinfizieren

Dieser Beitrag basiert auf einem realen Praxisfall aus dem HPLC-Troubleshooting.
Bei Fragen oder ähnlichen Problemen in deinem Labor
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Quellen

1. Waters: General Cleaning Procedure; https://support.waters.com (abgerufen: 05.10.2026)
2. Agilent: Beste Vorgehensweisen zur Verwendung eines LC-Systems von Agilent: Vorgehensweise zum Reinigen des Systems; https://agilent.com (abgerufen: 05.10.2026)
3. ThermoFisher: Operating Manual: Clean or decontaminate the system; https://www.thermofisher.com (abgerufen: 05.10.2026)

Zuletzt aktualisiert: Oktober 2026