TFA in der HPLC: Wenn die Welligkeit der Basislinie zum Problem wird

Die Welligkeit der Basislinie, auch als Mischungswelligkeit bezeichnet, ist ein Phänomen in der HPLC, wenn die Basislinie ein welliges Rauschen zeigt. Dieser Effekt wird durch verschiedene Komponenten beeinflusst wie TFA als Modifier, Pumpe, Art und Größe der Eluenten-Mischkammer und Messwellenlänge.

Der Endgegner in der HPLC? Es ist nicht ein verstopftes System oder schlecht getrennter Peak: Es ist die Welligkeit der Basislinie. Dies ist kein kosmetisches Problem: die Welligkeit kann Peaks verdecken und macht die Auswertung unsicher. Das Phänomen ist vor allem für TFA (Trifluoressigsäure) bekannt, welche als saurer Modifier eingesetzt wird. Bei der Detektion von Peptiden wird häufig um 220 nm gemessen. Je nach TFA-Gehalt, Gradient und System kann sich die Absorption der mobilen Phase dabei auf die Basislinie auswirken.

Woher kommt die Welligkeit der Basislinie?

Mehrere Ursachen können zur Welligkeit der Basislinie führen.

1. TFA absorbiert im tiefen UV

TFA absorbiert UV bei 190-200 nm. Das wäre kein Problem, um Peptide bei 220 nm zu messen, wenn wir isokratisch trennen. Meist ist aber ein Gradient für perfekte Trennung notwendig. Beim Gradient ändert sich das Verhältnis zwischen wässriger und organischer Phase ständig. Damit wird auch die Zusammensetzung (UV-Absorption) im Detektor geändert. Oft ist die Welligkeit am Anfang geringer als in der Mitte. Wie stark der Effekt auftritt, hängt von der Messwellenlänge, TFA-Gehalt, Steilheit des Gradienten ab.

2. Pumpe

Weit verbreitet sind quaternäre Pumpen in der HPLC. bei der Hochdruckpumpe werden die Eluenten mit separaten Pumpenköpfen gefördert und danach gemischt. Bei Niederdruckpumpen wird der Eluent durch ein Proportionierungsventil gemischt und dann gepumpt.

3. Mischkammer

Die Mischkammer ist die zentrale Komponente für die Mischung der Eluenten. Hier gibt es von Hersteller zu Hersteller Unterschiede. Statische Mischer mischen die Eluenten mithilfe von spiralförmiger Strukturen. Dynamische Mischer mischen durch einen Rührfisch. Bei der Mischkammer ist die Art der Mischung und das Mischvolumen entscheidend. Stavros Kromidas zeigt in seinem Beitrag eindrücklich, wie eine größere Mischkammer zu geringerem Rauschen führt.

4. Detektor

Die Einstellung der Detektor, z.B. Wellenlänge, Slit, Abtastrate, beeinflussen den Effekt: Je weiter weg die Messwellenlänge vom Absorptionsmaximum des TFAs entfernt ist, desto geringer ist ihr Beitrag zum Welligkeit.

Was bedeutet die Welligkeit für LOD und LOQ?

Die Nachweis- und Bestimmungsgrenze ist abhängig vom Basislinienrauschen (3 resp. 10 S/N). Wenn also die Basislinie wellig ist (→ höheres Rauschen), verschlechtert dies LOD und LOQ. Ein kleiner Peak ist schwer von der Welligkeit der Basislinie zu unterscheiden, da der Peak auf einer Welle oder im Tal „sitzt“. Das Problem: Die ganze Welligkeit gehört zum Rauschen, nicht nur der kleine Abschnitt vor oder nach dem Peak.

Wichtig: Die Welligkeit der Basislinie verändert nicht die Empfindlichkeit des Detektors, sondern verschlechtert die praktisch erreichbare Empfindlichkeit der gesamten Methode.

Das kannst du gegen die Welligkeit der Basislinie tun

Andere TFA-Konzentration im Acetonitril
Eine geringfügige Reduktion der TFA-Konzentration im organischen Eluenten bei der Gradientenmethode hilft den Effekt zu verringern. Der UV-Cutoff von Acetonitril selbst liegt bei 190 nm und durch die geringfügige Reduktion der TFA-Konzentration wird der Einfluss vermindert.

Höhere Messwellenlänge
Miss bei Absorptionsmaximum > 220 nm, falls dein Analyt dort noch eine ausreichende Absorption aufweist. Der Einfluss von TFA nimmt damit deutlich ab. Überprüfe in deiner Methodenentwicklung, ob du alle Peaks noch siehst. Denn andere Wellenlänge heißt andere Sichtbarkeit der Substanzen.

Anderer Modifier verwenden
Tausche den Modifier aus, z.B. Ameisensäure. Überprüfe Trennung, Peakform, Empfindlichkeit, denn ein Austausch kann die Selektivität beeinflussen.

Gradient und System prüfen
Äquilibriere dein System ausreichend, Eluent frisch ansetzen und entgasen. Überprüfe die Eluentenmischung, mögliche Pumpenpulsation Temperaturschwankungen. Überprüfe die Einstellungen deines Detektors.

Mischkammer
Baue eine größere, aktiv gemischte Mischkammer ein, wenn dies möglich ist.

Basislinie abziehen (Software)? → NICHT ZU EMPFEHLEN
(Nicht empfohlen) In vielen HPLC-Auswertprogrammen kann die Basislinie eines Blanks vom Sample abgezogen werden. Dies empfehle ich nicht, da dadurch wichtige Informationen womöglich verloren gehen. Es können zum Beispiel kleine Verunreinigungen (~ LOD) verschwinden. Ich arbeite mit den “unbearbeiteten” Daten und optimiere die Methode weiter. Achtung: Die Wellen tauchen im Blank und Sample nicht zur exakt gleichen Zeit auf, was für eine richtige Baselinesubstraction wichtig wäre.

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Überprüfung der Methode

Praktischer Tipp: Überprüfe die Methode mit mehreren Blankruns. Dies zeigt dir, ob die Basislinie stabil genug für die vorgesehene LOD und LOQ ist. Ich empfehle immer vor dem Sample einen Blank laufen zu lassen. Damit siehst du, welche Signal vom Blank-Lauf und welche von der Probe stammen.

Fazit

Die Welligkeit der Basislinie wird durch mehrere Komponenten verursacht: TFA und dessen Konzentration, Pumpe, Mischung, Messwellenlänge.

Bei der Methodenentwicklung müssen die UV-Absorption der TFA und ihre Einflüsse berücksichtigt werden. Eine ruhige Basislinie erreichst du, wenn Eluent, Systemeinstellungen und -Komponenten gut aufeinander abgestimmt sind.

Falls du weitere Fragen zur Welligkeit der Basislinie hast:
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Zuletzt aktualisiert: Oktober 2026